Effect of drought on photosynthetic characteristics, stomatal conductance and water use efficiency in juvenile pedunculate oak (Quercus robur L.) plants

Способы получения стерильных клонов тополя и осины (Populus ssp.) с использованием генной инженерии последовательность генов идентичности цветковой меристемы у тополя -гена LEAFY (LFY) и двух ортологов AGAMOUS (AG) [42].Для модельного вида генетики древесных P. trichocarpa было установлено удвоение последовательности всего генома, которое, вероятно, произошло примерно 60-65 млн лет назад.В результате почти 8 тысяч генов P. trichocarpa представлены в геноме двумя копиями (паралогами) [39].Таким образом, ген AGAMOUS (AG) также представлен в геноме двумя паралогичными последовательностями, в то время как LEAFY -уникален.Elorriaga с соавт.[14] сконструировали четыре направляющих (или гидовых) РНК (single guide RNA, sgRNA), чтобы оценить возможности системы CRISPR/Cas9 вносить целевые изменения (мутации) в последовательности генов LFY и AG.Авторы сконструировали шесть плазмид для доставки конструкций в клетки объекта.В результате экспериментов им удалось получить сотни трансгенных событий, в результате которых изменились последовательности генов-мишеней.Таким образом, была установлена высокая эффективность использования CRISPR/ Cas9 для нейтрализации генов цветения у тополей и получения стерильных клонов.Эта публикация содержит ценные методические рекомендации, однако в данном исследовании доставка C R I S P R / C a s о с у щ е с т в л я л а с ь п у т е м Agrobacterium-опосредованной генетической трансформации, что переводит полученные отредактированные растения в категорию ГМО.Размер генома тополя составляет всего около 550 Mb (млн пар оснований) [39], полногеномная сборка доступна для нескольких видов: P. trichocarpa [39], P. euphratica [23], P. tremula [22] и P. deltoides [5].Геномы разных видов Populus весьма сходны и коллинеарны [9].Поэтому для выявления последовательностей ДНК, подходящих в качестве мишени для редактирования с целью получения стерильных форм, в качестве старта можно использовать последовательность гена PLFY у P. trichocarpa (GenBank accession number U93196, Potri.015G106900),гомологичного гену LEAFY в геноме Arabidopsis, депонированную в БД Phytozome [17].Метод конструирования гидовых РНК для генов-мишеней при использовании системы CRISPR/Cas9 Дезоксирибонуклеаза Cas9 (CRISPR associated protein 9) -компонент иммунитета бактерий, который обеспечивает их защиту от чужеродной ДНК вирусов и плазмид.Уникальная особенность этого фермента заключается в том, что его специфичность можно программировать с помощью особой crРНК (CRISPR РНК).При этом для каталитической активности нуклеазы Cas9 нужна еще одна РНК -tracrРНК (trans-activating CRISPR РНК), которая частично комплементарна crРНК.Рибонуклеопротеиновый комплекс Cas9/ crРНК/tracrРНК способен распознавать участки ДНК, идентичные 20 нуклеотидам на 5'-конце crРНК.Эти нуклеотиды и составляют целевую последовательность редактируемого гена (или спейсер).При этом важно, чтобы к 5'-концу этой 20-нуклеотидной последовательности (спейсера) непосредственно примыкал так называемый PAM-мотив, распознаваемый Cas нуклеазой (например, CCN, в случае нуклеазы Cas9 бактерии Streptococcus pyogenes).Распознав PAM-мотив, белок Cas9 связывается с ним, а затем расщепляет обе цепи ДНК между 3 и 4 нуклеотидом (если считать в направлении 3'-5' от PAM-мотива).Направляющая РНК состоит из двух компонентов.Первый -консервативный компонентвключает последовательность crРНК (CRISPR РНК), подобную повторяющимся палиндромам в бактериальной клетке, переходящую в последовательность тракрРНК (tracrRNA) -транс-активирующую РНК, необходимую для присоединения Cas9.В современных конструкциях последовательности crРНК и тракрРНК объединены в единую последовательность -sgRNA скаффолд (single guide RNA scaffold).Вторая «часть» направляющей РНК -вариабельная, называемая спейсером, синтезируется комплементарно выбранному участку редактируемого гена и состоит из 17-20 нуклеотидов.Для дизайна спейсеров существует не

Ҳали таржима қилинмаган