Разработка методики оценки эпигенетического воздействия минорных нутриентов рациона питания на экспрессию гена Sirt1

Организм человека представляет собой сложно организованную систему эукариотических клеток, поддерживающих гомеостаз путем информационного взаимодействия, в том числе информации, поступающей от внешних источников. Функции информационно управляющей системы заключаются в формировании управляющих импульсов, поддерживающих метаболизм на уровне клетки, органов, систем, организма в целом. Одним из наиболее значимых для биологического объекта, в том числе и для человека, стрессовым фактором является ограничение калорийности его рациона. Можно предположить, что при снижении потребления энергоемких нутриентов ниже величины основного обмена организм вынужден переходить на «аварийные» режимы функционирования. Одним из таких механизмов является экспрессия генов семейства сиртуинов. Показано, что стимулирующее экспрессию генов семейства сиртуинов ограничение калорийности рациона способствует увеличению продолжительности жизни и повышению уровня адаптации к стрессовым ситуациям. Белки, кодируемые генами семейства сиртуинов, выступают в качестве катализаторов процесса транспереноса ацетильной группы при внутриклеточном обмене. В частности, белки сиртуинов участвуют в реакциях, регулирующих процессы старения внутриклеточных биологических структур, предотвращение нежелательной экспрессии генов, дифференциацию клеток по их функциональным признакам и др. Семейство сиртуинов включает 7 генов с различной информационной целенаправленностью. Гены кодируют синтез соответствующих гормонов, в частности белок SIRT1 очень чувствителен к соотношению окисленной и восстановленной форм НАД – никотинамидадениндинуклеотид, что важно для создания градиента протонов, который, в свою очередь, используется в реакции окислительного фосфорилирования при синтезе АТФ. Исследованиями показано, что каталитической активностью реакции восстановления НАД могут выступать органические соединения специфического воздействия. В качестве такого биоэкспрессора доказано применение ресвератрола и его производных. Цель работы – оценить влияние пищевых добавок – биоэкспрессоров кверцетина, ресвератрола, коэнзима Q10 и пептида карнозина – на изменение экспрессии мРНК гена Sirt1, участвующего в регуляции соотношений АМФ/АТФ и окисленной/восстановленной форм НАД. Для достижения поставленной цели были выполнены 3 последовательных этапа исследований. На первом этапе был осуществлен подбор праймеров и флюоресцентных зондов к мРНК генов Sirt1, GAPDH и B2M для проведения полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), их синтез и оценка их эффективности. В ходе выполнения второго этапа исследований осуществили выделение мРНК из образцов крови участников эксперимента, которые принимали в течение месяца биологически активные добавки. На третьем этапе была проведена одношаговая количественная ОТ-ПЦР в режиме реального времени с образцами мРНК, выделенными из крови добровольцев до и после курса приема ими БАД, для оценки изменения уровня экспрессии гена Sirt1. В результате проведенных исследований показано, что прием добровольцами биоэкспрессоров привел к экспрессии гена Sirt1. Полученные данные показывают, что включение в рацион питания исследованных биоэкспрессоров может вызывать повышение уровня экспрессии мРНК гена Sirt1 от 1,5 до 3 раз. The human body is a complexly organized system of eukaryotic cells that support homeostasis through information interaction, including information coming from external sources. The functions of the information management system consist in the formation of control impulses that support metabolism at the level of cells, organs, systems, and the body as a whole. One of the most significant stress factors for a biological object, including for humans, is the restriction of the caloric content of its diet. It can be assumed that with a decrease in the consumption of energy-intensive nutrients below the value of the basic metabolism, the body is forced to switch to «emergency» modes of functioning. One of these mechanisms is the expression of genes of the sirtuin family. It has been shown that caloric restriction, which stimulates the expression of sirtuin family genes, increases life expectancy and increases the level of adaptation to stressful situations. Proteins encoded by the genes of the sirtuin family act as catalysts for the process of acetyl group transference during intracellular metabolism. In particular, sirtuin proteins are involved in reactions regulating the aging processes of intracellular biological structures, the prevention of unwanted gene expression, cell differentiation according to their functional characteristics, and others. The sirtuin family includes 7 genes with different information targeting. The genes encode the synthesis of the corresponding hormones, in particular, the SIRT1 protein is very sensitive to the ratio of oxidized and reduced forms of NAD – nicotinamide adenine dinucleotide, which is important for creating a proton gradient, which, in turn, is used in the oxidative phosphorylation reaction during ATP synthesis. Studies have shown that the catalytic activity of the NAD reduction reaction can be organic compounds with specific effects. The use of resviratrol and its derivatives has been proven as such a bioexpressor. The aim of this work was to evaluate the effect of dietary supplements – bioexpressors of quercetin, resveratrol, coenzyme Q10 and the peptide carnosine on changes in the expression of the SIRT1 gene mRNA involved in the regulation of AMP/ATP ratios and oxidized/reduced forms of NAD. To achieve this goal, three consecutive stages of research were carried out. At the first stage, primers and fluorescent probes for the SIRT1, GAPDH, and B2M mRNAs were selected for reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), their synthesis, and evaluation of their effectiveness. During the second stage of the research, mRNA was isolated from blood samples of experimental participants who took dietary supplements for a month. At the third stage, real-time single-step quantitative RT-PCR was performed with mRNA samples isolated from the blood of volunteers before and after a course of taking dietary supplements to assess changes in the expression level of the SIRT1 gene. As a result of the conducted studies, it was shown that the intake of bioexpressors by volunteers led to the expression of the Sirt1 gene. The data obtained show that the inclusion of the studied bioexpressors a in the diet can cause an increase in the level of mRNA expression of the SIRT1 gene from 1.5 to 3 times.

Hali tarjima qilinmagan